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Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4755 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die aktuelle maschinelle Perfusionstechnologie ermöglicht die Ex-situ-Konservierung von Lebern für kurze Zeiträume, um die Lebensfähigkeit vor der Transplantation zu beurteilen. Die normotherme Langzeitperfusion von Lebern ist ein aufstrebendes Gebiet mit enormem Potenzial für die Beurteilung, Wiederherstellung und Modifikation von Organen. Ziel dieser Studie war es, ein Langzeitmodell der Ex-situ-Perfusion zu entwickeln, das eine chirurgische Spaltung und gleichzeitige Perfusion beider Teilorgane umfasst. Für eine Transplantation abgelehnte menschliche Lebern wurden mit einem Perfusat auf der Basis roter Blutkörperchen unter normothermen Bedingungen (36 °C) perfundiert und anschließend aufgeteilt und gleichzeitig auf separaten Maschinen perfundiert. Zehn menschliche Lebern wurden gespalten, sodass 20 Teillebern entstanden. Die mittlere Ex-situ-Lebensfähigkeit betrug 125 Stunden und die mittlere Ex-situ-Überlebenszeit betrug 165 Stunden. Das Langzeitüberleben wurde anhand der Laktatclearance, der Gallenproduktion, der Faktor-V-Produktion und der Speicherung von Adenosintriphosphat nachgewiesen. Hier berichten wir über die langfristige Ex-situ-Perfusion menschlicher Lebern und demonstrieren die Fähigkeit, diese Organe mithilfe eines standardisierten Protokolls zu spalten und zu perfundieren.

Die normotherme maschinelle Perfusionstechnologie bietet gegenüber herkömmlichen Techniken zur Organkonservierung vor der Transplantation eine Reihe von Vorteilen1. Die Perfusion einer gespendeten menschlichen Leber vor der Transplantation kann die Ex-situ-Konservierungszeit kurzfristig verlängern und gleichzeitig eine gewisse Beurteilung der Organlebensfähigkeit als Prädiktor für die Transplantatfunktion nach der Transplantation ermöglichen2,3. Das Hauptaugenmerk dieser Technologie lag bisher auf der Steigerung des Nutzens marginaler Organe durch kurzfristige Perfusion im Stundenbereich. Allerdings könnte eine Perfusion im Bereich von Tagen bis Wochen eine differenziertere Beurteilung dieser Organe mit der Möglichkeit einer Wiederherstellung oder Veränderung vor der Transplantation ermöglichen4,5. Dies könnte nicht nur die Anzahl der für eine Transplantation verfügbaren Organe erhöhen, sondern auch die Qualität der derzeit verwendeten Transplantate verbessern.

Zu diesem Zweck wurde über eine Perfusion von Lebern über einen Zeitraum von bis zu 7 Tagen unter Verwendung eines speziell angefertigten, integrierten Systems unter subnormothermen Bedingungen (34 °C) berichtet4. Die Perfusion bei dieser Temperatur hat schützende metabolische Wirkungen, simuliert jedoch nicht die tatsächlichen physiologischen Bedingungen6,7. Die gleiche Gruppe berichtete auch über die erfolgreiche Transplantation und einjährige Nachbeobachtung einer Leber, die drei Tage lang mit normothermer Ex-situ-Konservierung perfundiert wurde8. Über eine langfristige Perfusion menschlicher Lebern über 7 Tage hinaus unter normothermen Bedingungen (36 °C) wurde noch nie berichtet und könnte das Potenzial für die Regeneration und Modifikation von Organen vor der Transplantation freisetzen.

Die langfristige Ex-situ-Perfusion menschlicher Lebern unter normothermen Bedingungen stellt auch eine einzigartige Gelegenheit für die Ex-situ-Untersuchung lebenden menschlichen Gewebes dar. Durch die Aufteilung ganzer menschlicher Lebern während der normothermen maschinellen Perfusion, wie wir zuvor beschrieben haben9,10,11, kann diese Technologie auf zwei Teilleber angewendet werden. Dies könnte eine simulierte Umgebung für das Testen von Therapeutika mit einer angepassten Kontrolle und die Untersuchung von Leberschäden und -regeneration bieten.

In dieser Studie wollten wir ein Proof-of-Concept-Modell für die langfristige normotherme Ex-situ-Perfusion menschlicher Spaltleber entwickeln, um die Grenzen der Ex-situ-Perfusion zu erweitern, indem wir das Überleben über 7 Tage hinaus verlängern und gleichzeitig zwei Teilorgane perfundieren. Auf diese Weise wollten wir ein Modell zur Untersuchung der langfristigen Leberperfusion mit potenziellen Anwendungen in der translationalen Forschung und darüber hinaus entwickeln.

Alle Spenderleber in New South Wales, die zwischen Februar und Dezember 2021 einer klinischen Transplantation zustimmten und eine klinische Transplantation ablehnten, wurden für die Aufnahme in Betracht gezogen. Eine Leber war aufgrund einer bekannten Pfortaderhochdruck-Vorgeschichte zurückgegangen, eine zweite aufgrund einer Leberzirrhose. Zur Entwicklung des Protokolls wurden drei ganze Lebern ohne Aufteilung perfundiert. Unter Verwendung unseres Protokolls wurden 10 gespendete menschliche Lebern geteilt, was zu 10 LLSG und 10 ERGs führte, die auf separaten Perfusionsgeräten perfundiert wurden.

Bei den geteilten Lebern wurden vier der zehn Lebern über den Weg der Spende nach Hirntod (DBD) und sechs über den Weg der Spende nach zirkulatorischer Bestimmung des Todes (DCD) beschafft. Die Gründe für die Entsorgung gespendeter Lebern sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Einige dieser Lebern waren möglicherweise in anderen Zentren „transplantierbar“, aber die Entscheidung, sie zu verwenden, wurde nicht durch unser Studienprotokoll beeinflusst. Die Gründe dafür, die DBD-Lebern nicht für eine Transplantation zu verwenden, waren: Steatose, stark gestörte Leberfunktionstests, bekannte Gallensepsis und eine Leber mit schlechter Back-Table-Flush. Die DCD-Lebern wurden nicht klinisch verwendet, da das Alter in unserem Zentrum über den DCD-Akzeptanzkriterien (>50 Jahre) lag (>50 Jahre) in 3 von 6 Fällen, und in den übrigen Fällen aufgrund einer längeren Zeit bis zum Stillstand des Kreislaufs (>30 Minuten), krankhafter Fettleibigkeit usw Schärfe der Transplantationsaktivität. Die mittlere kalte ischämische Zeit (CIT, definiert als die Zeit von der Kaltperfusion bis zur Reperfusion unter Verwendung der Ex-situ-Maschine) betrug 295 Minuten (Interquartilbereich [IQR] 273–430 Minuten) (Ergänzungstabelle 1). Bei DCD-Lebern betrug die mittlere Zeit bis zum Tod (Entzug der kardiorespiratorischen Unterstützung bis zum Stillstand des Kreislaufs) 20 Minuten (IQR 19–29 Minuten) (Ergänzungstabelle 1).

Alle ganzen Lebern (3/3) zeigten nach Beginn der Perfusion eine schnelle Laktatclearance (ergänzende Abbildung 1A). Unter Verwendung unseres Protokolls für die Langzeitperfusion überlebten diese ganzen Lebern alle mehr als 7 Tage mit Anzeichen einer Laktatclearance und Gallenproduktion (ergänzende Abbildung 1B). Sobald der Laktatwert über 2,5 mmol/L anstieg, beobachteten wir eine irreversible Verschlechterung der Organfunktion, die letztlich in allen Fällen zum Organversagen führte.

Alle Lebern wurden kontinuierlich auf ihre hepatozelluläre Lebensfähigkeit gemäß den in der klinischen VITTAL-Studie2 vorgeschlagenen Kriterien untersucht. Abgesehen von zwei Lebern, die aufgrund eines technischen Fehlers beim Organtransfer frühzeitig versagten, blieben alle Lebern bis zu 48 Stunden Perfusion lebensfähig. Nach 5 Tagen Perfusion erfüllten 11/20 Lebern weiterhin die Lebensfähigkeitskriterien, und die mittlere Lebensfähigkeitszeit betrug insgesamt 125 Stunden (IQR 88–176 Stunden) (Abb. 1A, Ergänzungstabelle 2). Nachdem der Laktatwert auf > 2,5 mmol/L angestiegen war und die Lebensfähigkeitskriterien nicht mehr erfüllt waren, wurde die Perfusion für alle Teilleber explorativ fortgesetzt, um Veränderungen im Zusammenhang mit Organversagen zu charakterisieren. Die Zeit von der Nichtlebensfähigkeit bis zum vollständigen Organversagen (Laktat > 10 mmol/L und exponentieller Anstieg mit mangelnder Gallenproduktion oder nicht reagierender Hypoglykämie) betrug typischerweise <48 Stunden (16/20 Transplantate). Das mittlere Gesamtüberleben betrug 165 Stunden (IQR 113–224 Stunden), wobei 9/20 Lebern > 7 Tage und 4/20 Lebern > 10 Tage überlebten (Abb. 1B, Ergänzungstabelle 2). Das maximale Gesamtüberleben betrug 327,5 Stunden. Die hepatobiliäre Lebensfähigkeit wurde anhand der Kriterien der DHOPE-COR-NMP-Studie12 beurteilt. Dieselben beiden Lebern, die aufgrund eines technischen Fehlers versagten, waren nach diesen Kriterien ebenfalls nicht lebensfähig, aber alle anderen Teilleber erfüllten diese hepatobiliären Lebensfähigkeitskriterien für eine Perfusion von bis zu 48 Stunden (Ergänzungstabelle 3). Bemerkenswert ist, dass diese Lebern auch alle Galle mit einem pH-Wert von > 7,40 produzierten, was auf eine erhaltene Cholangiozytenfunktion hinweist (Ergänzungstabelle 3).

Die Lebensfähigkeit der Organe wurde kontinuierlich beurteilt, bis die Teilleber die Lebensfähigkeitskriterien* (A) nicht mehr erfüllte. Die Durchblutung wurde fortgesetzt, bis die Organe versagten (B), gekennzeichnet durch einen Laktatwert von >10 mmol/L mit mangelnder Gallenproduktion oder nicht reagierender Hypoglykämie. Alle Lebern zeigten Laktatclearance (C), Gallenproduktion (D), Produktion von Faktor V (E) und Hinweise auf Sauerstoffverbrauch (F) bis zum Organversagen. Der pH-Wert und die Glukose des Perfusats waren typischerweise während der Perfusion bis zum Organversagen stabil, was zu einer refraktären Azidose und einer nicht reagierenden Hypoglykämie führte (G, H). Der pH-Wert der Galle war typischerweise alkalisch und die Gallenglukose lag während der Perfusion typischerweise im hypoglykämischen Bereich (I, J). *Lebensfähigkeit gemäß den in der klinischen VITTAL-Studie vorgeschlagenen Kriterien (≤ 2,5 mmol/L und zwei oder mehr von: Gallenproduktion, pH ≥ 7,30, Glukosestoffwechsel, Leberarterienfluss ≥ 150 ml/min und Pfortaderfluss ≥ 500 ml /min oder homogene Perfusion)2.

Alle Teilleber zeigten eine Laktatclearance. Restliches Laktat aus gepackten roten Blutkörperchen, die zur Synthese des Perfusats verwendet wurden, wurde schnell von der gesamten Leber und dann vom ERG nach der Aufspaltung abgebaut (das ERG wurde mit „neuem“ Blut auf die zweite Perfusionsmaschine übertragen, während das LLSG mit der ersten verbunden blieb Perfusionsmaschine). Die Laktat-Clearance setzte sich während der Perfusion fort, wobei ein Perfusat-Laktatspiegel von typischerweise < 1,5 mmol/l aufrechterhalten wurde, bis es zum Organversagen kam, wo das Laktat exponentiell anstieg (Abb. 1C). Die Bilirubin-, GGT- und ALP-Werte im Perfusat blieben niedrig, stiegen jedoch während der Perfusion allmählich an, bis hin zum Organversagen (ergänzende Abbildung 2). Die ALT-Perfusatspiegel erreichten in den ersten 48–72 Stunden nach der Reperfusion der gesamten Leber ihren Höhepunkt, bevor sie ein Plateau erreichten und dann während der Langzeitperfusion abnahmen (ergänzende Abbildung 2).

Die Gallenproduktion war während der Perfusion sowohl in der linken als auch in der rechten Leber konstant, mit vergleichbaren Produktionsraten nach Anpassung an das Gewicht jeder Teilleber. Die Produktion verlangsamte sich typischerweise und hörte auf, was mit einem Organversagen einherging (Abb. 1D). Der pH-Wert der Galle wurde während der Perfusion typischerweise in einem alkalischen Bereich gehalten (Abb. 1I). In ähnlicher Weise blieben die Perfusat-Prothrombinzeit (PT) und die Faktor-V-Spiegel während der Perfusion in allen Teillebern bis zum Organversagen erhalten, und es gab Hinweise auf einen langfristigen Sauerstoffverbrauch in allen Lebern (Abb. 1E, F, ergänzende Abb . 2D). Der pH-Wert des Perfusats lag während der Perfusion typischerweise stabil zwischen 7,2 und 7,5, mit einer charakteristischen refraktären Azidose, die den Endstadien des Organversagens entsprach (Abb. 1G). Die Perfusatspiegel von Albumin, Harnstoff und Gesamtprotein blieben während der Perfusion ohne merkliche Veränderung bei Organversagen erhalten (ergänzende Abbildung 2).

Der Perfusatglukosespiegel war typischerweise in den ersten 48–72 Stunden der Perfusion hoch und blieb anschließend während der Langzeitperfusion im Bereich von 10–20 mmol/l (Abb. 1H). Das Ende der Perfusion war durch eine refraktäre Hypoglykämie gekennzeichnet, die einem Organversagen entsprach.

Wir verwendeten ein druckgesteuertes System, das eine unabhängige Kontrolle des Leberarterien- und Pfortaderdrucks mit Messung des Gefäßflusses ermöglichte. Im ERG erreichte die Kanülierung der rechten Leberarterie typischerweise Flüsse von 200 ml/min, und im LLSG erreichte die Kanülierung des Truncus coeliacus typischerweise ebenfalls Flüsse von 200 ml/min (Abb. 2A, B). Nach Anpassung an das Lebergewicht erreichte die LLSG deutlich höhere Flüsse/Minute/kg Leber als die ERG (Median 316 ml/Minute [IQR 224–613 ml/Minute] vs. 126 ml/Minute [IQR 72–209 ml/Minute]). , p = 0,003, 4 h nach der Spaltung) (Abb. 2C). Beim ERG erreichte die Kanülierung der Hauptportalvene typischerweise einen Fluss von 1,0 l/min, während beim LLSG die Kanülierung der linken Pfortader nur 300–400 ml/min erreichte (Abb. 2D, E). Die Anpassung anhand des Lebergewichts zeigte, dass diese Flussrate zwischen ERGs und LLSGs ähnlich war (Abb. 2F). Gefäßdrücke und -ströme blieben typischerweise während der Perfusion ohne Vasodilatator-Supplementierung stabil. Das Organversagen war durch einen starken Anstieg des Leberarterienwiderstands unmittelbar vor Beendigung der Perfusion gekennzeichnet.

Unter Verwendung eines druckgesteuerten Systems mit einem Ziel von 60 mmHg für die Leberarterie erreichten ERG und LLSG typischerweise einen Blutfluss von 200 ml/min (A, B). Nach Anpassung an das Lebergewicht erreichte die LLSG deutlich höhere Flüsse/Minute/kg Leber als die ERG (Median 316 ml/Minute [IQR 224–613 ml/Minute] vs. 126 ml/Minute [IQR 72–209 ml/Minute]). , p = 0,003, 4 h nach der Aufteilung, Mann-Whitney-U-Test) (C) (n = 20 Teilleber; 10 ERGs, 10 LLSGs, ausgedrückt als Median (IQR)). Bei einem Zielwert von 8 mmHg für die Pfortader erreichten ERG und LLSG typischerweise 1,0 l/min bzw. 300–400 ml/min (D, E). Nach Anpassung an das Lebergewicht war der Pfortaderfluss zwischen ERG und LLSGs (F) ähnlich (n = 20 Teilleber; 10 ERGs, 10 LLSGs, ausgedrückt als Median (IQR)). Die ATP- und Glykogenspiegel im Lebergewebe blieben während der Perfusion sowohl in ERGs als auch in LLSGs im Vergleich zum Ausgangswert (G, H) stabil oder stiegen an. ATP-Adenosintriphosphat, ERG-verlängertes rechtes Transplantat, LLSG-Transplantat des linken lateralen Segments, *p < 0,05.

Während der Perfusion entnommene Leberkernbiopsien zeigten Hinweise auf eine Energiespeicherung während der Langzeitperfusion. Die Lebergewebespiegel von Adenosintriphosphat (ATP) und Glykogen blieben während der Perfusion sowohl in LLSGs als auch in ERGs im Vergleich zum Ausgangswert stabil oder stiegen an (Abb. 2G, H).

Die Leberarchitektur blieb sowohl bei LLSGs als auch bei ERGs langfristig erhalten, mit geringen Raten an koagulativer Nekrose oder Hepatozytenablösung während der Perfusion (Abb. 3). In den Endstadien des Organversagens wurden zunehmend Hinweise auf Leberschäden und Architekturverzerrungen festgestellt (Abb. 3). Der Glykogenabbau verringerte sich während der Perfusion, was auf eine langfristig erhöhte Ablagerung von intrazellulärem Glykogen in den Hepatozyten hindeutet (Abb. 3B). Es wurden Hinweise auf eine Zellproliferation festgestellt, wobei sich die Hepatozyten vor und nach der Spaltung positiv auf Ki67 färbten. Allerdings nahm das Ausmaß der Zellproliferation gegen Ende der Perfusion ab (Abb. 3C, D). Gallengangsbiopsien zeigten eine Gallenschädigung mit Hinweisen auf eine Wandstroma-Nekrose; 80 % der Lebern zeigten jedoch ein intaktes Gallenepithel, was auf eine erhaltene Integrität des Gallenbaums hindeutet (ergänzende Abbildung 3).

Die Objektträger wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, um die architektonische Integrität zu beurteilen (A), mit Periodsäure-Schiff für den Glykogenabbau (B) und mit Ki67 für die Zellproliferation (C, D). Das Ausmaß der Zellproliferation nahm vom Anfang der Perfusion (C) bis zum späteren Zeitpunkt der Perfusion (D) ab. Die Beurteilung jedes Objektträgers wurde von einem verblindeten Pathologen auf Koagulationsnekrose (E), Hepatozytenablösung (F) und Glykogenmangel (G)22 durchgeführt. Das Ausmaß an koagulativer Nekrose und Hepatozytenablösung blieb bis zum Organversagen niedrig (E, F). Die Glykogenablagerung in den Hepatozyten nahm mit der Langzeitperfusion zu (G).

Durch die Gruppierung der Teilleber, die >7 Tage oder ≤7 Tage überlebten, untersuchten wir die Faktoren, die das langfristige Überleben vorhersagten. Insgesamt überlebten 9/20 Teillebern >7 Tage. Dazu gehörten 4 LLSGs und 5 ERGs, und diese Teillebern wurden von sechs verschiedenen ganzen Lebern abgeleitet. Die Spendereigenschaften unterschieden sich zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant. Das mittlere Spenderalter für Lebern, die >7 Tage und ≤7 Tage überlebten, betrug 52,8 ± 13,3 bzw. 53,6 ± 15,4 (p = 0,908). Die Spender aller Organe waren häufiger männlich (7/9 für Lebern, die >7 Tage überlebten, und 7/11 für Lebern, die ≤7 Tage überlebten) und wurden häufiger über den DCD-Weg entnommen (6/9 bzw. 6/11) (Ergänzungstabelle). 4).

Perfusat-Laktat- und Perfusat-Transaminasenspiegel (Bilirubin, Alaninaminotransferase [ALT], alkalische Phosphatase [ALP], Gamma-Glutamyltransferase [GGT]) unterschieden sich zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant (Abb. 4A, ergänzende Abb. 4). Die gewichtsbereinigte Rate der Gallenproduktion war in den Lebern, die > 7 Tage nach 24 Stunden, 60 Stunden und 72 Stunden nach der Aufteilung überlebten, signifikant höher (Median 3,674 ml/h/kg Leber [IQR 2,247–4,576 ml/h/kg Leber). ] vs. 1,714 ml/h/kg Leber [IQR 0,478–2,516 ml/h/kg Leber], p = 0,008 nach 24 Stunden) (Abb. 4B). Der Perfusatspiegel von Faktor V war in den Lebern, die > 7 Tage unmittelbar vor der Teilung überlebten, und zu jedem Zeitpunkt bis 72 Stunden nach der Teilung signifikant höher (Mittelwert 47,3 ± 19,9 % gegenüber 15,4 ± 12,7 %, p < 0,001 nach 24 Stunden). ) (Abb. 4C). Die Perfusat-PT war in Lebern, die > 7 Tage unmittelbar vor der Spaltung und 4 Stunden nach der Spaltung überlebten, signifikant kürzer (Abb. 4D). Perfusierter Harnstoff, Albumin, Gesamtprotein, Gallen-pH und Gallenglukose zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen (Abb. 4, ergänzende Abb. 4).

Die Perfusat-Laktatwerte unterschieden sich nicht signifikant zwischen Lebern, die >7 Tage oder ≤7 Tage überlebten (A). Die Gallenproduktion und die Faktor-V-Spiegel waren in den Lebern, die >7 Tage überlebten, signifikant höher (Galle: median 3,674 ml/h/kg Leber [IQR 2,247–4,576 ml/h/kg Leber] vs. 1,714 ml/h/kg Leber [ IQR 0,478–2,516 ml/h/kg Leber], p = 0,008 nach 24 Stunden, Mann-Whitney-U-Test; Faktor-V: Mittelwert 47,3 ± 19,9 % vs. 15,4 ± 12,7 %, p < 0,001 nach 24 Stunden, ungepaarte Zwei- einseitiger t-Test) (B, C). Die Prothrombinzeit war bei Lebern, die > 7 Tage unmittelbar vor und 4 Stunden nach der Spaltung überlebten, signifikant kürzer (Median 54 s [IQR 38–48 s] vs. 150 s [IQR 55–91 s] nach 4 Stunden, p = 0,015, Mann– Whitney-U-Test) (D). Sauerstoffverbrauch, perfusierter Harnstoff, Gallen-pH und Gallenglukose zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen (E–H). Der Leberarterienfluss war in den Lebern, die bei gleichem Leberarteriendruck länger als 7 Tage überlebten, signifikant höher (Median 615 ml/min [IQR 530–674 ml/min] vs. 342 ml/min [IQR 308–405 ml/min]). p = 0,002, kurz vor der Aufteilung, Mann-Whitney-U-Test) (I, J). Der Pfortaderdruck unterschied sich zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant (K). Der Pfortaderfluss war in den Lebern, die zwischen den Tagen 1 und 3 nach der Teilung >7 Tage überlebten, signifikant höher (Median 1,030 ml/min [IQR 0,320–1,310 ml/min] vs. 0,280 ml/min [IQR 0,220–0,970 ml/min] , p = 0,049, 1 Tag nach der Teilung, Mann-Whitney-U-Test) (L). Alle gruppierten Daten werden als Median (IQR) dargestellt, mit Ausnahme von Faktor V, der normalverteilt war und als Mittelwert (Standardabweichung) dargestellt wurde, n = 20 Teilleber, 9 überlebten >7 Tage, 11 überlebten ≤7 Tage. Normalverteilte Daten und nicht normalverteilte Daten wurden zu jedem gruppierten Zeitpunkt mit einem ungepaarten zweiseitigen t-Test bzw. einem Mann-Whitney-U-Test verglichen. *p < 0,05.

Der Leberarterienfluss war bei den Lebern, die mehr als 7 Tage sowohl vor als auch nach der Teilung überlebten, signifikant höher (Median 615 ml/min [IQR 530–674 ml/min] vs. 342 ml/min [IQR 308–405 ml/min], S = 0,002, kurz vor der Spaltung) (Abb. 4J). Dieser Unterschied wurde bei Druckkontrollzielen deutlich, die nur geändert wurden, um den Mindestdurchflussanforderungen gerecht zu werden. Nach Anpassung an das Gewicht jeder Leber war dieser Unterschied immer noch vorhanden, jedoch weniger ausgeprägt (ergänzende Abbildung 4). Die Pfortaderströme waren bei Lebern, die zwischen dem 1. und 3. Tag nach der Teilung >7 Tage überlebten, signifikant höher (Median 1,030 ml/min [IQR 0,320–1,310 ml/min] vs. 0,280 ml/min [IQR 0,220–0,970 ml/min] , p = 0,049, 1 Tag nach der Teilung) (Abb. 4L).

Der Schweregrad der mikrovesikulären Steatose, der bei Kernbiopsien vor der Teilung beobachtet wurde, war bei Lebern, die > 7 Tage überlebten, deutlich geringer (Median 5 % [IQR 0–7,5 %] vs. 20 % [IQR 5–35 %], p = 0,041 nach 0 Stunden ) (Abb. 5A). Der Schweregrad der makrovesikulären Steatose, der koagulativen Nekrose und der Hepatozytenablösung unterschied sich jedoch zwischen den beiden Gruppen nicht wesentlich (Abb. 3E, F und 5B).

Die Objektträger wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und von einem verblindeten Pathologen auf mikrovesikuläre (A) und makrovesikuläre (B) Steatose untersucht. Die bei Kernbiopsien vor der Teilung beobachtete mikrovesikuläre Steatose war bei Lebern, die > 7 Tage überlebten, deutlich weniger schwerwiegend (Median 5 % [IQR 0–7,5 %] vs. 20 % [IQR 5–35 %], p = 0,041 nach 0 Stunden, Mann –Whitney-U-Test) (A). Alle gruppierten Daten werden als Median (IQR) dargestellt, n = 20 Teilleber, 9 überlebten >7 Tage, 11 überlebten ≤7 Tage, *p < 0,05.

Dies ist die erste Studie, die ein Funktionsmodell der langfristigen normothermen maschinellen Perfusion menschlicher Spaltleber demonstriert. Bei Verwendung von Lebern, die in unserem Zentrum für Transplantationen nicht verwendbar waren, konnte eine Ex-situ-Konservierung für mehr als 7 Tage und bis zu maximal 13 Tage erreicht werden. Dies ist nicht nur die längste jemals beschriebene Ex-situ-Konservierung menschlicher Lebern, sondern wir berichten auch über die Perfusion von zwei Teilorganen aus derselben gesamten Leber. Eine Perfusion im Bereich von Tagen bis Wochen kann eine differenziertere Beurteilung der Lebensfähigkeit, die Reparatur von Organen vor der Transplantation und sogar die Regeneration ermöglichen1,4,5. Daher hat dieses Modell ein enormes Potenzial für die Untersuchung von Therapeutika mit einer ideal abgestimmten Kontrolle und als Modell für die translationale Forschung. Obwohl wir uns für diese Studie für eine traditionelle Aufteilung entschieden haben, um die Leber in ein LLSG und ein ERG zu unterteilen, könnte unser Protokoll leicht an eine Ganz-Links-Voll-Rechts-Aufteilung angepasst werden, um zwei Teilleber mit noch besserer Übereinstimmung bereitzustellen.

Darüber hinaus wurde dies durch die Modifikation eines kommerziell erhältlichen Leberperfusionssystems mit leicht verfügbaren Komponenten (Langzeitoxygenatoren, Gasmischer, Dialysefilter) erreicht. Dies hat den Vorteil, dass es leicht reproduzierbar und für andere Zentren mit Interesse an der Langzeitperfusion ganzer oder teilweiser Lebern zugänglich ist und den Weg für globale Zusammenarbeit und unzählige Möglichkeiten als Modell für translationale Forschung ebnet.

Dies ist auch die erste Beschreibung der Langzeitperfusion eines pädiatrischen Transplantats (LLSG). Dies birgt seine eigenen Herausforderungen im Zusammenhang mit der Gefäßknickung, der Aufrechterhaltung einer physiologischen Umgebung mit künstlich hohem Gefäßfluss und Blutvolumen sowie der Titration des Nährstoffbedarfs. Tatsächlich waren die hohen arteriellen und niedrigen portovenösen Flüsse im Vergleich zum ERG höchstwahrscheinlich auf die Verwendung des großen Truncus coeliacus und der kleinen linken Pfortader zur Kanülierung des LLSG zurückzuführen. Allerdings handelte es sich bei 4/9 Teillebern, die >7 Tage überlebten, um LLSG. Die maschinelle Perfusionsrevolution muss im Bereich der Pädiatrie13 noch verwirklicht werden, möglicherweise aufgrund technischer Herausforderungen. Dennoch ebnen die in dieser Studie erzielten Anpassungen und Modifikationen den Weg für diese Fortschritte.

Zu den weiteren Herausforderungen bei der Verwendung dieses Protokolls gehörte die Intensität, die für die manuelle Anpassung der Infusionen und Dialyseeinstellungen erforderlich war. Das in dieser Studie verwendete modifizierte kommerzielle System erforderte stets eine genaue Überwachung und algorithmische Anpassung der Parameter (ergänzende Abbildung 5). Dies könnte in Zukunft durch eine digitale Steuerung und Automatisierung der Maschine durch ein individuelles Design und die Integration mehrerer Systeme verbessert werden.

Die maschinelle Langzeitperfusion der Leber ist noch weitgehend unerforscht. Eine Schweizer Gruppe perfundierte erfolgreich ganze Lebern und Teilleber nach einer Hepatektomie mit einem speziell angefertigten integrierten Perfusionsgerät4,14. Durch integrierte Automatisierung und subnormotherme Temperaturen von 34 °C6 wurde eine Perfusion von 7 Tagen erreicht. Im Gegensatz dazu verwendeten wir tatsächliche normotherme Bedingungen (36 °C), was eine genaue Simulation physiologischer Bedingungen und eine Bewertung ohne metabolische Beeinträchtigungen ermöglicht. Auch die Perfusion gespaltener Lebern wird als Forschungsmodell kaum genutzt. Bisher betrug die längste Perfusion passender Teillebern 6 Stunden unter Verwendung eines künstlichen Sauerstoffträgers und einer traditionellen Ex-situ-Aufteilung15. Unser Modell könnte in Zukunft an die klinische Transplantation angepasst werden, mit dem Vorteil einer kürzeren kalten Ischämiezeit, wobei die Aufspaltung ohne Unterbrechung des Gefäßzuflusses und einer kontinuierlichen Perfusion beider Lebern auf lange Sicht erfolgt, was ausreichend Zeit für eine differenziertere Bewertung lässt.

Die Langzeitperfusion hat uns zu einem besseren Verständnis der Veränderungen verholfen, die während der Ex-situ-Maschinenperfusion unter normothermen Bedingungen auftreten. Trotz Nahrungsergänzung und hormoneller Nahrungsergänzung sowie Blutfiltration mittels Dialyse versagten alle Lebern in dieser Studie schließlich. Dies deutet darauf hin, dass es eine „Goldlöckchen“-Periode gibt, in der diese Lebern am besten sind. Während dieser Zeit wurde die Leber lange genug durchblutet, um eine angemessene Wiederbelebung und Reparatur sowie eine Beurteilung der Lebensfähigkeit zu ermöglichen, jedoch nicht zu lange, so dass die Leberqualität abnimmt und die irreversible Verschlechterung bis hin zum Organversagen einsetzt. Mithilfe der in der klinischen VITTAL-Studie vorgeschlagenen Rentabilitätskriterien konnten wir in dieser Studie den wahrscheinlichen Punkt ohne Wiederkehr (typischerweise etwa fünf Tage) identifizieren. Es muss auch die Lebensfähigkeit der Galle berücksichtigt werden, die voraussichtlich unabhängig von der Lebensfähigkeit der Leberzellen ist16. Daher sind anspruchsvollere und weniger subjektive Kriterien erforderlich3.

Zu diesem Zweck konnten wir durch die Gruppierung von Lebern, die in dieser Studie >7 Tage und ≤7 Tage überlebten, mithilfe der Leberbiochemie, Markern der synthetischen Leberfunktion, Leberhämodynamik und Histopathologie Prädiktoren für das Langzeitüberleben identifizieren. Organe, die länger als 7 Tage überlebten, wiesen eine deutlich höhere Gallenproduktionsrate, höhere Faktor-V-Spiegel, höhere Leberarterienflüsse und geringere Mengen an mikrovesikulärer Steatose auf. Diese Veränderungen machten sich innerhalb der ersten 48–72 Stunden der Perfusion bemerkbar und stellten potenzielle Ziele für die Definition einer Signatur für das Langzeitüberleben dar. Dies hat nicht nur Auswirkungen auf die Beurteilung der inhärenten Organqualität, sondern diese Signatur kann auch in Echtzeit neu bewertet werden und uns bei der Wiederbelebung und Genesung dieser Lebern auf lange Sicht unterstützen.

Die Beurteilung der Lebensfähigkeit und langfristigen Überlebensfähigkeit von Organen in dieser Studie ist durch die fehlende Validierung durch Transplantation eingeschränkt. Leider galten die für die Forschung in dieser Studie verfügbaren Lebern als ungeeignet für eine Transplantation, weshalb eine Bewertung durch Transplantation in diesem Rahmen nicht möglich war. Dies gab uns jedoch die Gelegenheit, diese Lebern bis zum Versagen zu untersuchen, was wertvolle Informationen über die metabolischen und hämodynamischen Muster lieferte, die beim Absterben des Organs auftreten. Wichtig ist, dass das Erreichen dieser Ergebnisse mit marginalen Organen darauf schließen lässt, dass wir wahrscheinlich zuverlässigere und sogar längere Überlebensergebnisse erzielen können, wenn wir dies auf ideale Organe anwenden, die für eine Transplantation geeignet sind. Auch diese Studie konzentrierte sich vor allem auf die Organlebensfähigkeit aus der Perspektive der hepatozellulären Funktion. Zukünftige Arbeiten sollten eine detailliertere Untersuchung der cholangiozellulären Funktion und eine Bewertung der langfristigen Lebensfähigkeit der Gallenwege durchführen.

Schließlich ist es ein Bereich der laufenden Forschung unserer Gruppe, zu verstehen, warum all diese Organe letztendlich versagen. Im Hinblick auf Organversagen haben wir ein charakteristisches Muster beobachtet, das einen raschen Anstieg des Laktats, einen zunehmenden hepatischen Gefäßwiderstand mit geringen arteriellen und portovenösen Flüssen in der Leber, eine refraktäre Perfusatazidose und eine nicht reagierende Hypoglykämie umfasst. Organversagen kann sekundär zu einem Fehlen einer wichtigen Stoffwechselkomponente, die für die Aufrechterhaltung der Energiehomöostase erforderlich ist, oder einer Verschlechterung der Perfusatqualität im Laufe der Zeit, da Blutprodukte nicht aufgefüllt oder aufgefrischt wurden, zurückzuführen sein17. Dieses Modell bleibt auch ohne Darm-Leber-Achse oder automatisierte zirkadiane Variation unphysiologisch18. Diese Gründe könnten erklären, warum die meisten Lebern nach 5–7 Tagen Perfusion unweigerlich zu versagen begannen. Alternativ kann ein Wachstumsfaktor-Stimulus fehlen, der den Hepatozyten signalisiert, sich zu regenerieren1. Zukünftige Arbeiten sollten darauf abzielen, zu verstehen, warum diese Organe versagen, das Potenzial zur Erhaltung dieser Organe über Wochen bis Monate zu erschließen und mehr Zeit für sinnvolle Eingriffe und Regeneration zu schaffen.

Die Fähigkeit, menschliche Spaltleber langfristig unter normothermen Bedingungen zu perfundieren, birgt ein enormes Potenzial. In dieser Studie beschreiben wir ein Funktionsmodell, das ein modifiziertes, kommerziell erhältliches Leberperfusionssystem verwendet, um gespaltene menschliche Lebern für >7 Tage zu perfundieren. Dieses Modell stellt die längste Perfusion menschlicher Lebern ex situ unter normothermen Bedingungen dar und hat neue Informationen darüber geliefert, wie diese Organe für den klinischen Einsatz bewertet werden können und warum sie langfristig versagen. Wir beschreiben ein Modell, das für die Ex-situ-Perfusion pädiatrischer Organe und für die Erweiterung der Anwendungen der Ex-situ-Perfusionstechnologie geeignet ist. Darüber hinaus hat diese Technik ein enormes Potenzial für die Erprobung von Therapeutika und ebnet den Weg für die Zusammenarbeit in den Bereichen Transplantation, Grundlagenwissenschaften und darüber hinaus.

Menschliche verstorbene Spenderlebern, deren Transplantation abgelehnt wurde, wurden gemäß einem ethischen Protokoll, das vom Sydney Local Health District Ethics Review Committee (X18-0523 & 2019/ETH08964) genehmigt wurde, für die Forschung angenommen. Die Einwilligung zur Forschung wurde zum Zeitpunkt der Einwilligung zur Organspende von der zentralisierten Spendenorganisation in Australien, DonateLife, eingeholt. Wir haben DBD- und DCD-Lebern in Betracht gezogen und ein Organ nur abgelehnt, wenn klinische oder biochemische Hinweise auf eine Leberzirrhose vorlagen. Alle Lebern wurden mit unserer Standardtechnik mit Aortenspülung unter Verwendung von kaltem Soltran (Baxter Healthcare, Illinois, USA) und einer Konservierungslösung der University of Wisconsin (Belzer UW, Bridge to Life, Columbia, USA) gewonnen, gefolgt von einer statischen Kühllagerung für den Transfer zu unserem Center. Es wurden keine Organe hingerichteter Häftlinge verwendet.

Wir haben ein kommerzielles Leberperfusionssystem (Liver Assist, Xvivo, Groningen, Niederlande) wie zuvor beschrieben unter Verwendung kommerziell erhältlicher Geräte modifiziert9,10,11. Dieses System nutzt eine Doppelpumpenkonfiguration mit einem offenen Venenreservoir und einer Thermoregulationseinheit. Die Änderungen sind in Abb. 6 zusammengefasst. Wir haben die kommerziell erhältlichen Oxygenatoren durch Langzeitoxygenatoren (Quadrox-iD Pediatric, Macquet, Getinge Group, Rastatt, Deutschland) ersetzt und einen Gasmischer (Low Flow 2003 Series, Bio-Med) hinzugefügt Devices, Connecticut, USA) und pädiatrische Durchflussregler zum präzisen Mischen von Druckluft mit Sauerstoff. Außerdem haben wir parallel einen Dialysefilter mit einstellbaren Ein- und Ausgangssteuerungen angeschlossen (Prismaflex oder Polyflux, Baxter Healthcare, Illinois, USA).

Ein kommerziell erhältliches Organperfusionssystem (Liver assist, Xvivo, Groningen, Niederlande), das ein Doppelpumpensystem (P) und ein offenes Venenreservoir verwendet, wurde für die Langzeitperfusion durch Zugabe von Langzeitoxygenatoren (A), einem Gas, modifiziert Mixer (B) und einem Dialysefilter (C).

Ein Perfusat auf der Basis roter Blutkörperchen wurde unter Verwendung von 4 Einheiten gespendeter gepackter roter Blutkörperchen, 2 Einheiten gespendetem frisch gefrorenem Plasma, 200 ml 20 %igem Albumin und 1 l normaler Kochsalzlösung hergestellt. Das System wurde durchgehend mit Enoxaparin (100 mg zweimal täglich, Clexane, Sanofi-Aventis, Auckland, NZ) gerinnungshemmend behandelt und das Perfusat vor dem Anschluss an die Leber durch kontinuierliche Perfusatzirkulation durch den Dialysefilter und Korrektur von Elektrolytanomalien „gereinigt“. . Sobald physiologische Bedingungen erreicht waren, wurden die gespendeten menschlichen Lebern vor der sofortigen Perfusion durch Pfortader- und Leberarterienkanülen mit normaler Kochsalzlösung gespült. Mithilfe eines druckgesteuerten Systems wurden Zielwerte von 60 mmHg und 8 mmHg für die Leberarterie bzw. die Pfortader gewählt. Für die Leberarterie wurde eine 18-20F Arterienkanüle (Organ Assist, Groningen, Niederlande) und für die Pfortader eine 25F Pfortaderkanüle (Organ Assist, Groningen, Niederlande) verwendet. Ziel war es, einen Leberarterienfluss von >400 ml/min und einen Pfortaderfluss von >1,2 l/min zu erreichen. Die kontrollierte Wiedererwärmung wurde mit einem Temperaturanstieg von 1 °C pro Stunde für 4 Stunden (von anfänglichen 32 °C auf 36 °C) durchgeführt, um die Perfusion in einem Temperaturbereich aufrechtzuerhalten, der das Überleben der roten Blutkörperchen begünstigt und die Auswirkungen einer Ischämie-Reperfusionsschädigung minimiert12. 19.

Zur Minimierung einer bakteriellen Kontamination wurde eine Antibiotikaprophylaxe mit Cefazolin (1 g täglich, AFP Pharmaceuticals, NSW, AUS) durchgeführt. Um das Überleben zu fördern, wurden Taurocholsäure (7,7 mg/h, Cayman Chemical Company, Michigan, USA) und Methylprednisolon (Solu-Medrol, rekonstituiert auf 10 mg/ml, 21 mg/h, Pfizer, NSW, AUS) zugesetzt. Die Ernährungsunterstützung erfolgte durch kontinuierliche Infusionen von Aminosäuren (Synthamin 17, Baxter Healthcare, Illinois, USA) und Lipiden (Clinoleic 20 %, Baxter Healthcare, Illinois, USA). Einmal täglich wurden ein Multivitaminpräparat (Cernevit, 1 Durchstechflasche, Baxter Healthcare, Illinois, USA) und Thiamin (Thiaminhydrochlorid, 100 mg/ml, 1 Durchstechflasche, Biological Therapies, VIC, AUS) verabreicht. Laktat, pH-Wert, Glukose, pO2 und pCO2 wurden mit einem Blutgasanalysator gemessen, um die Echtzeitänderung von Infusionen zu ermöglichen (RAPIDPoint 500, Siemens Healthengineers, Norwood, Massachusetts, USA). Der Glukosespiegel wurde manuell im Bereich von 5–15 mmol/l gehalten, indem titrierbare Infusionen von Insulin (Actrapid 100 IU/ml, verdünnt auf 2 IU/ml, typischer Bereich: 2–6 IU/h, Novo Nordisk, Auckland, NZ) und Glucagon verwendet wurden (GlucaGen rekonstituiert auf 1 mg/ml und verdünnt auf 20 μg/ml, typischer Bereich: 40–120 μg/h, Novo Nordisk, Auckland, NZ) und Glucose (10 %, typischer Bereich 5–20 ml/h, Baxter Healthcare). , Illinois, USA). Das Säure-Basen-Gleichgewicht und die Sauerstoffversorgung wurden manuell durch Anpassung des Sauerstoff-Druckluft-Verhältnisses und Regulierung des Gasflusses aufrechterhalten, wobei ein pH-Wert von 7,3–7,45 und ein pO2 von 100–200 mmHg angestrebt wurden. Die Dialysefiltration unter Verwendung von Dialysat ohne Ergänzung (Hemosol B0, Baxter Healthcare, Illinois, USA) wurde manuell angepasst, um Kalium im Bereich von 3–5 mmol/L und Hämoglobin im Bereich von 55–65 g/L zu halten. Alle manuellen Anpassungen wurden, soweit möglich, protokolliert und algorithmisch durchgeführt (ergänzende Abbildung 5). Eine Auffüllung roter Blutkörperchen war nicht erforderlich. Schwere Azidose (typischerweise zu Beginn oder am Ende der Perfusion wurde mit 10-ml-Aliquots Natriumbicarbonat 8,4 % (8,4 g in 100 ml, Phebra, NSW, AUS) behandelt. Arterieller Vasospasmus (im Zusammenhang mit der Handhabung der Leber oder der Verabreichung von Medikamenten). ) wurde mit 2,5-mg-Boli Verapamil (Isoptin, 5 mg/2 ml, Viatris, NSW, AUS) behandelt.

Bei gespaltenen Lebern wurde die Teilung am Tag nach Beginn der Perfusion durchgeführt, was einer Perfusion der gesamten Leber von 12 bis 16 Stunden entsprach. Die Leber wurde ex situ mit kontinuierlicher dualer Perfusion unter Verwendung der zuvor beschriebenen Technik gespalten9,10,11. Kurz gesagt, die Leber wurde in ein linkes laterales Segmenttransplantat (LLSG, Segmente 2 und 3) und ein erweitertes rechtes Transplantat (ERG, Segmente 1 und 4–8) unterteilt. Der Truncus coeliacus wurde dem LLSG zugeordnet und die Hauptportalvene blieb beim ERG. Zur Kanülierung der rechten Leberarterie (für das ERG) wurde ein 10-12F-Foley-Katheter und zur Kanülierung der linken Pfortader (für das LLSG) ein 18F-Foley-Katheter verwendet. Der gemeinsame Gallengang (mit dem ERG) und der linke Lebergang (mit dem LLSG) wurden zur Sammlung der Galle mit einer Kanüle versehen.

Nach Abschluss der Parenchym- und Gefäßdissektion wurde das ERG auf ein zweites modifiziertes Leberperfusionssystem übertragen. Die Ernährungsunterstützung wurde an die Größe der Organe angepasst. Für die gesamte Leber wurden druckkontrollierte Ziele auf 60 mmHg bzw. 8 mmHg für die Leberarterie und die Pfortader festgelegt. Dies wurde manuell angepasst, um minimale arterielle Flüsse von 150 ml/min und portovenöse Flüsse von 300 ml/min für das LLSG und arterielle Flüsse von 150 ml/min und portovenöse Flüsse von 800 ml/min für das ERG zu erreichen.

Alle Lebern wurden kontinuierlich anhand der in der klinischen VITTAL-Studie vorgeschlagenen Lebensfähigkeitskriterien beurteilt (Laktat ≤ 2,5 mmol/l und zwei oder mehr von: Gallenproduktion, pH ≥ 7,30, Glukosestoffwechsel, Leberarterienfluss ≥ 150 ml/min und Pfortader). Fluss ≥500 ml/min oder homogene Perfusion)2. Die Perfusion wurde fortgesetzt, bis die Organe eindeutig nicht mehr lebensfähig waren, wobei der Forschungsschwerpunkt auf dem Verständnis der physiologischen Veränderungen beim Organsterben lag. Die Perfusion wurde gestoppt, wenn das Perfusat-Laktat > 10 mmol/L betrug oder exponentiell anstieg, und es kam zu einem Stillstand der Gallenproduktion und einer nicht reagierenden Hypoglykämie. Die Lebensfähigkeit der Leber gemäß der DHOPE-COR-NMP-Studie (Laktat <1,7 mmol/L, pH 7,35–7,45, Gallenproduktion >10 ml und Gallen-pH >7,45) wurde ebenfalls während der Perfusion beurteilt, einschließlich einer Bewertung der Gallenlebensfähigkeit12. Unser Langzeitperfusionsprotokoll für gespaltene menschliche Lebern ist in Abb. 7 zusammengefasst.

Gespendete menschliche Lebern werden unter normothermen Bedingungen für 12–24 Stunden wiederbelebt, bevor eine konventionelle Teilung durchgeführt wird. Das linke laterale Segmenttransplantat und das verlängerte rechte Transplantat werden dann auf separaten Perfusionsgeräten perfundiert, um die Leberfunktion langfristig anhand von Funktionstests, hämodynamischer Bewertung und Histopathologie zu beurteilen.

Zur Beurteilung biochemischer Marker und Veränderungen im Laufe der Zeit wurden täglich Perfusatproben und Leberkernbiopsien entnommen. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Tests vom klinischen Labor des Royal Prince Alfred Hospital, Sydney, Australien, gemessen. Leberfunktionstests (Bilirubin, ALT, GGT, ALP) wurden auf Anzeichen einer Leberschädigung im Laufe der Zeit untersucht. Die synthetische Funktion der Leber wurde anhand von Perfusat-Laktat, PT und Faktor-V-Spiegeln beurteilt. Die Gallenproduktion wurde alle 4–6 Stunden gemessen und an das Gewicht jeder Teilleber angepasst, ausgedrückt in ml/h/kg. Der pH-Wert und die Glukose von Perfusat und Galle wurden mit einem Blutgasanalysator (RAPIDPoint 500, Siemens Healthengineers, Norwood, Massachusetts, USA) bestimmt.

Der Sauerstoffverbrauch wurde mithilfe des Henry-Gesetzes geschätzt, wobei der Gehalt an freiem und gebundenem Sauerstoff in der Leberarterie, der Pfortader und der Lebervene einzeln berechnet wurde: \([{O}_{2}=p{O}_{2}\times k +s{O}_{2}\times {Hb}\times c]\), wobei pO2 und sO2 der Sauerstoffpartialdruck bzw. die Sauerstoffsättigung sind, k der Sauerstofflöslichkeitskoeffizient und c der Sauerstoff- Tragfähigkeit von Hämoglobin. Dies wurde verwendet, um die gesamte Sauerstoffextraktions-/-verbrauchsrate unter Verwendung des Leberarterien-, Pfortader- und Lebervenenflusses zu berechnen und an das Gewicht der Leber anzupassen: 20,21

Der ATP- und Glykogengehalt des Lebergewebes wurde mit dem ATP Bioluminescent Kit (FLAA Sigma-Aldrich) bzw. dem Glykogen Assay Kit (MAK016, Sigma-Aldrich) gemäß den Anweisungen des Herstellers (Supplementary Notes 1) bestimmt.

Die Biopsien wurden in Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, bei 4 μm geschnitten und mit Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen (H&E) und Periodensäure-Schiff-Färbungen (PAS) gefärbt. Die histologische Beurteilung wurde von einem verblindeten Pathologen mit Erfahrung in Lebertransplantationen und Lebererkrankungen durchgeführt. Alle Fragen wurden durch Rücksprache mit einem zweiten Pathologen geklärt. Jeder Objektträger wurde mithilfe eines strukturierten quantitativen Bewertungssystems auf makrovesikuläre und mikrovesikuläre Steatose, koagulative Nekrose, Hepatozytenablösung und Glykogenmangel untersucht und bewertet22. An ausgewählten Objektträgern wurde eine Ki67-Immunhistochemie durchgeführt, um Hinweise auf Zellproliferation zu ermitteln. Gallengangsbiopsien wurden auf Wandstroma-Nekrose und Gallenepithelschäden untersucht.

Mit GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, Kalifornien, USA) wurden Diagramme erstellt und statistische Analysen durchgeführt. Die Daten für jede Teilleber wurden nach der Zeit nach der Aufteilung gruppiert und je nach Bedarf als Mittelwert ± Standardabweichung oder Median (IQR) ausgedrückt. Kontinuierliche Variablen wurden zu jedem gruppierten Zeitpunkt unter Verwendung eines ungepaarten zweiseitigen t-Tests oder eines Mann-Whitney-U-Tests verglichen. Ergebnisse wurden als signifikant angesehen, wenn p < 0,05.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle zur Reproduktion dieser Studie erforderlichen Daten finden Sie im Manuskript, in den Abbildungen und in ergänzenden Informationen. Die Quelldaten für Tabellen und Abbildungen in dieser Studie werden mit diesem Dokument in der Quelldatendatei bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken M. Xiang, N. Koutalistras und L. Gao für ihre Unterstützung und Hilfe. Wir möchten uns auch bei DonateLife und allen Organspendern und ihren Familien für ihre Unterstützung bedanken, ohne die diese Forschung nicht möglich wäre. Die finanzielle Unterstützung erfolgte durch das Royal Prince Alfred Hospital Transplant Institute. Einige in dieser Studie verwendete Geräte wurden von Johnson und Johnson bereitgestellt (Harmonic Scalpel, Eschelon Stapler). NL wird durch das Stipendienstipendium des Australian Government Research Training Program unterstützt. ML wird durch den University of Sydney University Postgraduate Award unterstützt. MC-C. wird durch das NSW Health Early-Mid Career Research Grant unterstützt.

Zentrum für Organbeurteilung, Reparatur und Optimierung, Royal Prince Alfred Hospital, Sydney, New South Wales, 2050, Australien

Ngee-Soon Lau, Mark Ly, Andrew Jacques, Shamus Toomath, Joanna Huang, Nicole Mestrovic, Paul Yousif, Sumon Chanda, Chuanmin Wang, Geoffrey McCaughan, Michael Crawford und Carlo Pulitano

Australian National Liver Transplantation Unit, Royal Prince Alfred Hospital, Sydney, New South Wales, 2050, Australien

Ngee-Soon Lau, Mark Ly, Andrew Jacques, Shamus Toomath, Joanna Huang, Nicole Mestrovic, Paul Yousif, Sumon Chanda, Chuanmin Wang, Ken Liu, Geoffrey McCaughan, Michael Crawford und Carlo Pulitano

Fakultät für Medizin und Gesundheit, The University of Sydney, Sydney, New South Wales, 2006, Australien

Ngee-Soon Lau, Mark Ly, Andrew Jacques, Joanna Huang, Nicole Mestrovic, Chuanmin Wang, Ken Liu, James G. Kench, Geoffrey McCaughan, Michael Crawford und Carlo Pulitano

Abteilung für Gewebepathologie und diagnostische Onkologie, NSW Health Pathology, Royal Prince Alfred Hospital, Sydney, New South Wales, 2006, Australien

Claude Dennis und James G. Kench

Forschungseinheit für translatorische Vektorologie, Institut für medizinische Forschung für Kinder, Universität Sydney, Westmead, Sydney, New South Wales, 2145, Australien

Marti Cabanes-Creus & Leszek Lisowski

Militärisches Institut für Medizin, Labor für Molekulare Onkologie und innovative Therapien, 04-141, Warschau, Polen

Leszek Lisowski

Australian Genome Therapeutics Centre, Children's Medical Research Institute und Sydney Children's Hospitals Network, Westmead, NSW, 2145, Australien

Leszek Lisowski

Centenary Institute, Sydney, New South Wales, Australien

Geoffrey McCaughan

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NL beteiligte sich am Forschungsdesign, führte die Forschung durch, analysierte die Daten und verfasste die Arbeit. ML, CD führte die Recherche durch, analysierte die Daten und überprüfte das Manuskript. AJ, MC-C., ST, JH, NM, PY, SC, CW führten die Recherche durch und überprüften das Manuskript. LL, KL, JK, GM und MC waren am Forschungsdesign beteiligt und haben das Manuskript kritisch überprüft. CP war am Forschungsdesign beteiligt, führte die Forschung durch, analysierte die Daten und überprüfte das Manuskript.

Korrespondenz mit Carlo Pulitano.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Robert Porte, Guillaume Rossignol und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Lau, NS., Ly, M., Dennis, C. et al. Langfristige normotherme Ex-situ-Perfusion menschlicher Spaltleber über mehr als eine Woche. Nat Commun 14, 4755 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40154-8

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Eingegangen: 21. Februar 2023

Angenommen: 14. Juli 2023

Veröffentlicht: 08. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40154-8

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