Eine neuartige quantitative gezielte Analyse von X

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12856 (2023) Diesen Artikel zitieren

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X-Chromosomen-Inaktivierungsanalysen (XCI) helfen oft bei der Diagnose von X-chromosomalen Merkmalen, eine genaue Beurteilung bleibt jedoch mit den aktuellen Methoden eine Herausforderung. Wir haben eine neuartige Strategie namens XCI-ONT entwickelt, die die amplifikationsfreie Cas9-Anreicherung und die Sequenzierung mit Oxford-Nanoporentechnologien nutzt, um XCI im menschlichen Androgenrezeptor-Gen (AR) und im menschlichen X-chromosomalen Retinitis pigmentosa 2-Gen (RP2) zu untersuchen und rigoros zu quantifizieren. XCI-ONT misst die Methylierung über 116 CpGs in AR und 58 CpGs in RP2 und trennt die X-Chromosomen der Eltern ohne PCR-Bias. Wir zeigen den Nutzen der XCI-ONT-Strategie gegenüber der PCR-basierten Golden-Standard-XCI-Technik, die nur ein oder zwei CpGs pro Gen untersucht. Die Ergebnisse verdeutlichen die Einschränkungen der Verwendung der Golden-Standard-Technik, wenn das XCI-Muster teilweise verzerrt ist, und die Vorteile von XCI-ONT zur rigorosen Quantifizierung von XCI. Diese Studie stellt eine universelle XCI-Methode für DNA bereit, die im klinischen und Forschungsrahmen für X-chromosomale Merkmale von großem Wert ist.

Die X-Chromosomen-Inaktivierung (XCI) ist ein Kompensationsmechanismus für den Unterschied in der Anzahl der X-Chromosomen zwischen Männern (46XY), Frauen (46XX) und Personen mit X-Aneuploidien1. Der menschliche molekulare XCI-Mechanismus ist nicht vollständig geklärt2,3, aber Studien haben gezeigt, dass XCI durch cis- und trans-wirkende Faktoren im X-Inaktivierungszentrum (Xic) gesteuert wird, einschließlich der Genexpression des X-inaktiven spezifischen Transkripts (XIST). und X-aktive spezifische Transkript-Gene (XACT)3. Dies führt schließlich zur monoallelischen Expression und zur Akkumulation von H3K27me33 und zur Methylierung von CpG-Stellen in der Nähe von Promotoren von Genen auf dem inaktiven X-Chromosom (Xi) (Abb. 1A)4,5,6. Methylierung hat sich als wichtig für die Aufrechterhaltung des inaktiven Zustands von Xi erwiesen7,8,9,10. XCI wird beim Menschen im frühen Embryonalimplantationsstadium eingeleitet3, und die Wahl, welches X-Chromosom inaktiviert werden soll, wird im Allgemeinen als zufälliger Prozess beschrieben, bei dem beide X-Chromosomen gleichermaßen vertreten sind11,12. Es wurde jedoch beobachtet, dass die bevorzugte Inaktivierung eines X-Chromosoms, das sogenannte skewed XCI, die Manifestation der Zellselektion aufgrund eines mutierten Zellnachteils13,14,15,16. Erstens wurde die bevorzugte Stummschaltung des pathogenen Allels mit einem selektiven weiblichen Überleben oder einer weniger schwerwiegenden Auswirkung von X-chromosomalen Merkmalen in Verbindung gebracht. Es hat sich gezeigt, dass eine extreme Schiefe ein guter Indikator für das Vorhandensein pathogener X-chromosomaler Varianten bei Trägerweibchen ist15,17,18 und XCI-Analysen bei Familienangehörigen helfen daher oft bei der Interpretation von Zweitens kann die Expression des pathogenen Allels bei Trägerweibchen zur Manifestation von Phänotypen mit X-chromosomalen Merkmalen führen19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 und kann die bei betroffenen Trägerweibchen beobachteten phänotypischen Unterschiede erklären Personen mit X-Aneuploidien21,24,29,30,31,32,33,34,35,36. Bemerkenswert ist, dass die Durchführung von XCI-Analysen in relevanten Geweben, in verschiedenen Altersstufen und bei Nichtrauchern empfohlen wird37,38,39,40,41,42,43,44. Im Allgemeinen war die Definition der Schiefe > 80:20, aber aufgrund von Einschränkungen in der für die XCI-Analyse verwendeten Golden-Standard-Technik wurde die Quantifizierung der Schiefe für andere als 100:0-Stummschaltungen nicht empfohlen, was die Notwendigkeit einer quantitativen Methode unterstreicht .

(A) Schematische Darstellung des X-Chromosomen-Inaktivierungsmechanismus und seiner Wirkung bei weiblichen Trägern X-chromosomaler Merkmale. Blau: aktives X-Chromosom (Xa), rot: inaktives X-Chromosom (Xi), gelber Stern: pathogene X-chromosomale Variante. Mit Adobe Illustrator 2022 erstellte Illustrationen (verfügbar unter https://adobe.com/products/illustrator). (B) Die Goldstandard-XCI-Methoden verwenden methylierungsempfindliche Restriktionsenzyme (HpaII), die das Xa schneiden, das Xi jedoch intakt lassen. HpaII zielt auf zwei bzw. eine CpG-Stelle im Androgenrezeptor (AR) bzw. Retinis pigmentosa 2 (RP2) ab und wird durch PCR und Fragmentlängenanalyse (FLA) über polymorphe repetitive Regionen (CAGn oder GAAAn) gefolgt, die die Elternallele trennen. Mit Adobe Illustrator 2022 erstellte Illustrationen (verfügbar unter https://adobe.com/products/illustrator). Der XCI-ONT-Ansatz schneidet die DNA unabhängig vom Methylierungsstatus mithilfe der CRISPR-Cas9-Anreicherung mit drei gRNAs (rosa), die eine interessierende Region (ROI) von ~ 3 kb flankieren, die 116 CpG-Stellen in AR und 58 CpG-Stellen in RP2 umfasst. (C) XCI-ONT umfasst: (1) Dephosphorylierung von 5'-Enden, um die Ligation von Sequenzierungsadaptern an Off-Target-Stränge zu reduzieren. (2) Das CRISPR-Cas9-System bindet und schneidet den ROI, und die DNA wird mit einem dA-Schwanz versehen, um die Adapterligation an die Cas9-Schnittseiten zu ermöglichen, die sowohl einen 3'-dA-Schwanz als auch eine 5'-Phosphorylierung aufweisen. (3) Die Bibliothek wird mithilfe von Oxford Nanopore Technologies und Bonito Base Calling sequenziert. (4) Aufrufen von Wiederholungen durch Ausrichten der Lesevorgänge an Referenzgenomen, die alle möglichen Wiederholungen in den Regionen enthalten, und Unterteilen der Lesevorgänge in Haplotypen durch Auftragen der Anzahl der Lesevorgänge mit unterschiedlichen Wiederholungen. Abschließend werden Methylierungsaufruf und Quantifizierung mit Nanopolish durchgeführt und die Daten mit Integrative Genomics Viewer (IGV) visualisiert. Die durchschnittliche Methylierung des ROI wird berechnet und das XCI-Verhältnis zwischen den beiden X-Chromosomen bestimmt.

Die Goldstandard-XCI-Analyse verwendet Methylierungsempfindliche Restriktionsenzyme (MSREs), PCR und Fragmentlängenanalyse (FLA), die auf zwei Regionen auf dem X-Chromosom abzielen; das erste Exon des menschlichen Androgenrezeptor (AR)-Gens45 und die Promotorregion des menschlichen X-chromosomalen Retinitis pigmentosa 2 (RP2)-Gens46. Die Methylierung von CpG-Stellen in diesen Regionen ist mit XCI beim Menschen verbunden46,47,48 und durch die Verwendung verschiedener MSREs mit verschiedenen Zielsequenzen werden eine oder mehrere CpG-Stellen in diesen Genen häufig mithilfe der Golden-Standard-Analyse untersucht. Die Methylierung von CpGs in AR und RP2 ist für XCI-Analysen aufgrund ihrer Nähe zu hochkonservierten polymorphen repetitiven Elementen (CAGn in AR und GAAAn in RP2, Heterozygotierate 0,97 zusammen) von besonderem Interesse, die zur Trennung der Elternallele mithilfe von FLA verwendet werden können ( Abb. 1B). Allerdings ist die Golden-Standard-Analyse nicht robust, da sie für die Verdauung auf MSREs basiert, PCR-basiert und semiquantitativ ist. Die Ergebnisse sind oft schwer zu interpretieren, da PCR-Stotter-Peaks, Sekundärstrukturen und/oder Polymorphismen im Fragment die Fragmentgröße beeinflussen und dadurch die Trennung der Allele verzerren. Darüber hinaus eignen sich PCR und FLA nicht zur Quantifizierung einer unausgeglichenen Expression der beiden X-Chromosomen, wobei häufig das kleinere Fragment bevorzugt wird49.

Eine Quantifizierung ist erforderlich, wenn der Grad der Schiefe < 100:0 ist und in der Grauzone der Schiefedefinition (> 80:20), die häufig bei der Interpretation von X-chromosomalen Varianten verwendet wird. Darüber hinaus kann die Quantifizierung sehr nützlich sein, wenn XCI eine Krankheit verändert, z. B. bei der Untersuchung von Trägerweibchen, die Symptome aufgrund der Expression des pathogenen Allels zeigen (unvollständige Stummschaltung). Es wurden bereits Ansätze zur Quantifizierung der XCI-Spiegel auf dem mütterlichen und väterlichen Allel vorgeschlagen, dies erfordert jedoch entweder Bisulfit-Umwandlung und PCR50 oder gepaarte RNA- und DNA-Sequenzierungsdaten des XIST-Gens unter Verwendung informativer transkribierter heterozygoter Einzelnukleotidvarianten (SNVs) zur Trennung des Elternteils Allele41,51. Ein SNV ist nicht so informativ wie wiederholte Elemente und kann daher nicht zur Unterscheidung zwischen Personen verwendet werden. Dies unterstreicht die Notwendigkeit einer universellen quantitativen XCI-Analyse der DNA für Forschungsanwendungen und klinische Diagnostik im Zusammenhang mit X-chromosomalen Merkmalen.

Mithilfe der ONT-Sequenzierung (Oxford Nanopore Technologies) kann die CpG-Methylierung nachgewiesen werden, die durch Änderungen im elektrischen Rohsignal während des Sequenzierungsprozesses aufgedeckt wird. Lange Lesevorgänge sind hilfreich, um die Methylierung über repetitive Regionen und GC-reiche Sequenzen wie CpG-Inseln zu untersuchen. Darüber hinaus ist eine hohe Abdeckung ohne Amplifikation eine sehr nützliche quantitative Messung der Methylierung. Allerdings ist eine hohe Lesetiefe des gesamten Genoms teuer und daher könnte ein Anreicherungsansatz von Vorteil sein. Kürzlich wurde eine amplifikationsfreie zielgerichtete Bibliotheksvorbereitung vor der Long-Read-Sequenzierung unter Verwendung des CRISPR-Cas9-Systems veröffentlicht, um komplizierte Zielregionen effektiv mit hoher Abdeckung und ohne PCR-Bias zu sequenzieren52,53,54,55,56. Analysen ohne PCR-Schritte sind wichtig, um Allel-Dropout zu vermeiden und eine quantitative Messung der Methylierung zu ermöglichen. Hier demonstrieren wir eine neuartige Strategie zur Quantifizierung von XCI mithilfe der CRISPR-Cas9-Anreicherung der AR- und RP2-Regionen zusammen mit der ONT-Sequenzierung zur Erkennung von Wiederholungen und Methylierungen. Die neuartige Strategie wird in diesem Artikel als XCI-ONT bezeichnet und mit der Goldstandard-XCI-Methode verglichen (Abb. 1B, C).

In dieser Studie wurde XCI zunächst mithilfe der PCR-basierten Goldstandard-Strategie der AR- und RP2-Gene untersucht. Bei der untersuchten Familie wurde zuvor eine X-chromosomale geistige Behinderung (OMIM #300966) beschrieben, die durch eine TAF1-Variante (c.3568C > T;p.(Arg1190Cys), NM_004606.4) verursacht wurde, wobei Trägerweibchen einen um ~ 100:0 verzerrten XCI aufwiesen Untersuchung des AR-Gens57. Das XCI-Ergebnis wurde in dieser Studie durch die Untersuchung des RP2-Locus von zwei asymptomatischen Trägerinnen (IV:8, III:10) und einer asymptomatischen Nicht-Trägerin (III:7) bestätigt (ergänzende Abbildung 1). Die beiden asymptomatischen Trägerweibchen wiesen einen um etwa 100:0 verzerrten XCI-Status auf, der damit übereinstimmt, dass das mütterliche X-Chromosom stumm ist (die pathogene Variante trägt). Das asymptomatische Weibchen ohne Träger zeigte die Expression beider Allele, d. h. einen zufälligen XCI-Status. Die Methode liefert jedoch unterschiedliche Ergebnisse zwischen den Experimenten und gegensätzliche Ergebnisse in den verschiedenen Genen (63:37 in AR vs. 47:53 in RP2). Zusätzlich wurden drei Weibchen (Weibchen I, II und III) mit der Golden-Standard-Methode untersucht. Alle Personen zeigten unterschiedliche XCI-Verhältnisse sowohl für AR (weiblich I 62:38, weiblich II 47:53 und weiblich III 81:19) als auch für RP2 (weiblich I 81:19, weiblich II 60:40 und weiblich III 87:13). (Tabelle 1, ergänzende Abbildung 2).

Um die Einschränkungen der Golden-Standard-Technik zu beseitigen und das Verhältnis der aktiven mütterlichen oder väterlichen X-Chromosomen zu quantifizieren, haben wir XCI-ONT entwickelt und auf dieselben Proben angewendet (Abb. 1B, C). XCI-ONT verwendet das Cas9-Anreicherungsprotokoll53 mit drei gRNAs auf beiden Seiten einer ~ 3 kb großen Region, die sich über dieselben Wiederholungen und CpG-Stellen erstreckt wie die Goldstandardmethode der AR- und RP2-Gene (Ergänzungstabelle 1). Auf die Regionsanreicherungen folgte eine DNA-Sequenzierung und ein gleichzeitiger Methylierungsnachweis mittels ONT-Sequenzierung. Dies ermöglicht den direkten Nachweis von Wiederholungen ohne PCR-Bias und den Methylierungsnachweis von 116 CpGs in AR (chrX: 67543761–67546170, hg38) und 58 CpGs in RP2 (chrX: 46836539–46837273, hg38) im Vergleich zur Golden-Standard-Untersuchungstechnik nur ein oder zwei CpGs pro Gen45,46. Die XCI-ONT-Untersuchung ergab zwischen 43 und 155 Lesevorgänge für das Ziel, von denen 32–105 zur Berechnung der Methylierungshäufigkeiten zur Trennung der Haplotypen verwendet wurden (Ergänzungstabelle 2). Die Wiederholungen wurden durch Abgleich mit dem Referenzgenom nachgewiesen, das jeweils eine Reihe natürlich vorkommender Wiederholungslängen in jedem Gen enthielt. Die Anzahl der Wiederholungen im neuartigen XCI-ONT-Assay in AR und RP2 stimmte mit den Basenpaarunterschieden überein, die mit dem Golden-Standard-Assay festgestellt wurden (Ergänzende Abbildungen 1, 2 und 3). Das Aufrufen der Methylierung und die Berechnung der Methylierungshäufigkeit wurden mit Nanopolish58 durchgeführt. Der Methylierungsstatus wurde visualisiert und der XCI-Status anhand der durchschnittlichen Methylierungshäufigkeit in den genannten Regionen berechnet, gefolgt von der Berechnung des Verhältnisses der durchschnittlichen Methylierung zwischen den Allelen in jedem Gen. Die beiden asymptomatischen Trägerweibchen (IV:8 und III:10) zeigten unter Verwendung von XCI-ONT einen verzerrten XCI-Status mit einem Methylierungsverhältnis von 95:5 (IV:8) und 97:3 (III:10) in AR und 91 :9 (IV:8) und 91:9 (III:10) in RP2. Die asymptomatische Nichtträgerin (III:7) wies einen zufälligen XCI-Status mit einem Methylierungsverhältnis von 31:69 in AR und 34:66 in RP2 auf (Tabelle 1, Abb. 2 und Ergänzungstabelle 3). Die Weibchen I und II zeigten einen zufälligen XCI-Status, und die Weibchen III zeigten einen zufälligen XCI-Status für AR, aber einen verzerrten XCI-Status für RP2. Weibchen I wurde zweimal (Weibchen II und Weibchen I.II) mit einer neuen DNA-Probe analysiert, um die Robustheit der Methode zu untersuchen. Die Verhältnisse waren wie folgt; 28:72 (weiblich II), 27:73 (weiblich I.II), 54:46 (weiblich II) und 81:19 (weiblich III) in AR und 26:74 (weiblich II) 27:73 (weiblich). I.II), 67:33 (weiblich II) und 92:8 (weiblich III) in RP2. Die Ergebnisse von Frau I waren zwischen den beiden getrennten Läufen sehr konsistent (28:72 vs. 27:73) und demonstrierten die Robustheit und Spezifität für XCI-ONT (Tabelle 1, ergänzende Abbildung 4 und ergänzende Tabelle 3). Die Variabilität der Methylierungsaufrufe zwischen den beiden Haplotypen über alle Lesevorgänge und analysierten CpG-Stellen hinweg wurde untersucht und visualisiert. Für IV:8 und III:10 ist sowohl für AR als auch für RP2 ein deutliches Muster für die Mehrzahl der CpG-Stellen zwischen methylierten und nicht methylierten Haplotypen erkennbar (ergänzende Abbildung 5A – D). Bei den Weibchen I und II können die verschiedenen Haplotypen anhand des Methylierungsstatus nicht unterschieden werden (Ergänzende Abbildung 5E – L). Frau III weist keinen Unterschied zwischen den Haplotypen für AR auf, zeigt jedoch eine klare Trennung zwischen den Haplotypen für RP2 (ergänzende Abbildung 5M, N).

Visualisierung des XCI-ONT-Ergebnisses mit Integrative Genomics Viewer (IGV), das methylierte CpG-Stellen (rot; Xi) und nicht methylierte CpG-Stellen (blau; Xa) über die Lesevorgänge in den Genen Androgenrezeptor (AR) und Retinis pigmentosa 2 (RP2) darstellt. Asymptomatische Überträgerweibchen (IV:8, III:10) weisen ein verzerrtes XCI-Muster auf und asymptomatische Nichtüberträgerweibchen (III:7) derselben Familie haben einen zufälligen XCI-Status. Die obere Leiste in jeder Haplotyp-Visualisierung zeigt die Leseabdeckung (Höhe) und den Prozentsatz methylierter und nicht methylierter Aufrufe an jeder Position an.

Wir demonstrieren eine Kombination aus CRISPR-Cas9-Anreicherung und ONT-Sequenzierung (XCI-ONT) als neuartige erfolgreiche Strategie zur Quantifizierung von XCI bei Frauen, die zur Untersuchung X-chromosomaler Merkmale verwendet werden kann. Hier wurde XCI in einer Familie mit einer Die Goldstandard-XCI-Untersuchung von Trägerweibchen (IV:8 und III:10) ergab einen um etwa 100:0 verzerrten XCI-Status im AR und RP2, was dazu führte, dass das pathogene Allel als Schutzmechanismus gegen Krankheiten stillgelegt wurde. Die Golden-Standard-XCI-Untersuchung einer asymptomatischen Nichtträgerin derselben Familie (III:7) sowie drei weiterer Individuen (Weibchen I-III) exprimierte beide Allele (zufälliges XCI), die Golden-Standard-Methode lieferte jedoch unterschiedliche Ergebnisse dazwischen Experimente und gegensätzliche Ergebnisse in den verschiedenen Genen (63:37 in AR, 47:53 in RP2 für III:7 und 62:38 in AR, 81:19 in RP2 für Frau I). Die Ergebnisse verdeutlichen die Einschränkungen der Verwendung der Golden-Standard-Methode, wenn das XCI-Muster nur teilweise verzerrt ist45,46.

Um dieses Problem anzugehen und das Verhältnis der aktiven mütterlichen oder väterlichen X-Chromosomen zu quantifizieren, haben wir XCI-ONT entwickelt und es auf dieselben Proben wie in der Golden-Standard-Analyse angewendet. Die XCI-ONT-Methode erkennt 116 CpGs im AR-Gen und 58 CpGs im RP2-Gen, verglichen mit nur einem oder zwei CpGs pro Gen mit der Golden-Standard-Methode45,46. Die beiden asymptomatischen Trägerinnen zeigten einen verzerrten XCI-Status mit 95:5 (IV:8) oder 97:3 (III:10) im AR-Gen und 91:9 im RP2-Gen (IV:8 und III:10). , was mit den Ergebnissen des Goldenen Standards übereinstimmt und das in diesem Dokument vorgestellte etablierte XCI-ONT-Protokoll bestätigt. Die asymptomatische Nichtträgerin (III:7) und die Frau I zeigten mithilfe von XCI-ONT einen zufälligen XCI-Status mit einem Methylierungsverhältnis von 31:69 und 28:72 in AR bzw. 34:66 und 26:74 in RP2, was darauf hindeutet eine deutlich andere und robuste Erkennung mit XCI-ONT im Vergleich zur Golden-Standard-Untersuchung, die gegensätzliche Ergebnisse zwischen Genen und Experimenten lieferte (63:37 und 62:38 in AR, 47:53 und 81:19 in RP2). Diese Ergebnisse zeigen einen robusten XCI-Nachweis unterschiedlicher Verhältnisse in beiden Genen und bestätigen, dass die quantitative XCI-ONT-Untersuchung bevorzugt wird, wenn das XCI-Muster teilweise verzerrt ist. Trotz der geringen Stichprobengröße dieser Studie zeigen die Ergebnisse eine genauere XCI-Untersuchung mit großem quantitativem Potenzial unter Verwendung der neuartigen XCI-ONT-Strategie im Vergleich zur semiquantitativen Golden-Standard-Methode. Wir zeigen auch, dass die erneute Analyse einer Person mit einer neuen DNA-Probe zum gleichen Ergebnis führt, was die Robustheit der Methode demonstriert.

Zur Unterscheidung der Allele nutzen sowohl der Golden Standard als auch die XCI-ONT-Strategie den Vorteil hochkonservierter polymorpher repetitiver Elemente in AR und RP2. Wiederholungen sind für die Trennung von Chromosomen nützlich, da sich Elternallele häufig in der Anzahl der Wiederholungseinheiten unterscheiden. Die Golden-Standard-Untersuchung verwendet FLA für einen indirekten Nachweis der Wiederholungen und trennt die Allele nach Fragmentgröße. Folglich kann die Haplotypteilung durch Indels und Fluorophore oder Sekundärstrukturen beeinflusst werden, die die erkannte Fragmentlänge beeinflussen. ONT ist in der Lage, Wiederholungen direkt zu erkennen, was die Leistungsfähigkeit der Verwendung von XCI-ONT für die Haplotypteilung unterstreicht. Diese Schlussfolgerung wurde gestützt, da der Unterschied in den Wiederholungslängen zwischen den beiden Haplotypen beim Vergleich der beiden Methoden konsistent war, außer bei Frau I, wo der zweite Haplotyp 22 Wiederholungen bei FLA und 39 Wiederholungen bei Verwendung von XCI-ONT zeigte. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass FLA eine PCR-basierte Methode ist, die die große Anzahl von Wiederholungen nicht verarbeiten kann.

Um die XCI-Schiefe zu untersuchen, verwenden sowohl der Golden Standard als auch die XCI-ONT-Strategie den Methylierungsgrad der verschiedenen Haplotypen in AR und RP2. Allerdings weist die Methode des Goldenen Standards Einschränkungen auf, da sie für die Verdauung auf MSREs angewiesen ist und nur die Methylierung einer oder einiger weniger CpG-Stellen in der Region untersucht. Im Vergleich dazu untersucht die XCI-ONT-Strategie die Methylierung von 116 CpG-Stellen in AR und 58 CpG-Stellen in RP2 mithilfe der ONT-Sequenzierung. Um die Häufigkeit von Methylierungsaufruffehlern zu berücksichtigen, wurden in diese Analyse nur Lesevorgänge mit stetigen Methylierungsaufrufen einbezogen (siehe Abschnitt „Methoden“). Daher haben einige CpG-Stellen möglicherweise keinen Methylierungsstatus (ergänzende Abbildung 5), und daher wird der XCI-ONT-Status als Verhältnis der durchschnittlichen Methylierung zwischen den Chromosomen angegeben. Zukünftige Studien, die mehr Proben umfassen, können Aufschluss darüber geben, welche Standorte am zuverlässigsten für die Analyse geeignet sind, und somit diese Methode verfeinern und die Genauigkeit noch weiter verbessern. Theoretisch führt XCI-ONT, bestätigt durch die Ergebnisse dieser Studie, zu einer genaueren XCI-Messung im Vergleich zu Golden-Standard-Methoden, insbesondere bei teilweise verzerrten Frauen, was auf die Leistungsfähigkeit der Verwendung von ONT und mehr als einer CpG-Stelle in XCI-Analysen hinweist. Dies wird durch die Variabilität der Methylierung bestätigt, die an den CpG-Stellen in den beiden Haplotypen aller untersuchten Personen beobachtet wurde (ergänzende Abbildung 5).

In dieser Studie wurden sowohl das AR- als auch das RP2-Gen zur Bestätigung des XCI-Status verwendet. Das Methylierungsverhältnis der Allele kann in den Genen aufgrund einer schlechten Haplotypteilung aufgrund von ≤ 2 Wiederholungen im Unterschied in RP2, mehr CpGs in der untersuchten AR-Region oder Methylierungsaufruffehlern leicht abweichen. XCI-ONT birgt das Potenzial, die Anzahl der gRNAs zu erhöhen, die auf zusätzliche X-chromosomale Gene abzielen, und so die Genauigkeit weiter zu verbessern. Darüber hinaus ermöglicht eine Einschränkung beim Methylierungs-Calling bisher nur die Methylierungserkennung innerhalb von 10-Basenpaar-Fenstern und daher kann XCI-ONT nicht mit der Golden-Standard-Methode auf CpG-Standortebene verglichen werden. Obwohl dies mit Nanopolish noch nicht möglich ist, entwickelt sich diese Forschung ständig weiter und wird voraussichtlich bald möglich sein.

Parallel zu unserer Studie wurde gezeigt, dass die ONT-Sequenzierung ein vielversprechendes Instrument zur Untersuchung von XCI über das Darüber hinaus wurde die Leistung der ONT-Sequenzierung im Vergleich zu XCI-Methoden des Goldenen Standards bisher nicht nachgewiesen.

Zusammenfassend demonstrieren wir zum ersten Mal, dass XCI-ONT eine neuartige erfolgreiche Strategie zur Quantifizierung von XCI bei Trägerweibchen von X-chromosomalen Merkmalen ist. Dies ist in der klinischen Arbeit und Forschung nützlich, wenn sich der Patient in der Grauzone der verzerrten Definition (> 80:20) befindet, und hilft oft bei der Interpretation X-chromosomaler Varianten. Darüber hinaus kann die Quantifizierung bei der Untersuchung von Trägerweibchen, die aufgrund der Expression des pathogenen Allels Symptome zeigen, von großem Nutzen sein. Die Quantifizierung von XCI kann den Krankheitsmechanismus aufklären und nützliche Informationen zur Verbesserung der pränatalen Risikobewertung36, der Diagnostik und der Behandlungsentwicklung von X-chromosomalen Merkmalen liefern. Abschließend möchten wir die Möglichkeit beleuchten, dass verschiedene Erkrankungen und pathogene Varianten unterschiedliche Expressionsniveaus erfordern, um Symptome zu entwickeln, und den Einsatz einer quantitativen XCI-Untersuchung zur Beantwortung dieser Fragen hervorheben. Eine verwandte Anwendung für XCI-ONT ist die Überwachung der pharmakologischen Xi-Reaktivierung, die zur Behandlung von X-chromosomalen Erkrankungen aufgrund von XCI-Verzerrungen vorgeschlagen wurde59,60,61,62.

Die ethische Genehmigung wurde von der örtlichen Ethikkommission der schwedischen Ethikprüfungsbehörde für Humanforschung in Uppsala, Schweden, erhalten (Dnr 2012/321). Die Proben wurden in der Abteilung für klinische Genetik des Universitätskrankenhauses Uppsala rekrutiert und von allen Teilnehmern wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Die Studie wurde gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Genomische HMW-DNA wurde aus 200 µl Blut von sechs Weibchen mit dem Nanobind CBB Big DNA-Kit (Circulomics) gemäß Standardverfahren oder mit der Aussalzmethode (Standardprotokoll auf Anfrage erhältlich) extrahiert, gefolgt von einer Reinigung mit dem Nanobind CBB Big DNA-Kit (Zirkulomik). Bei der in dieser Studie untersuchten Familie wurde zuvor eine X-chromosomale geistige Behinderung (OMIM #300966) beschrieben, die durch eine c.3568C > T;p.(Arg1190Cys)-Variante im TAF1-Gen (NM_004606.4)57 verursacht wurde. In die aktuelle Analyse wurde DNA von zwei Trägerweibchen (III:10, IV:8) und einem Nicht-Trägerweibchen (III:7) sowie drei nicht verwandten Weibchen (Weibchen I-III) einbezogen.

Zweihundert ng genomische DNA wurden mit methylierungsempfindlichem HpaII FastDigest in einem Gesamtvolumen von 20 µl gemäß den Anweisungen des Herstellers (Thermo Fisher Scientific) geschnitten. Eine das AR-Gen umfassende PCR wurde unter Verwendung eines Long-Range-PCR-Kits (Qiagen) mit Zugabe von 50 ng DNA oder 2 µl verdauter DNA mit Primern und den oben beschriebenen Zyklusbedingungen durchgeführt45. Das RP2-Gen wurde in einer 20-µl-Reaktion amplifiziert, die 1X PCR-Reaktionspuffer, 250 nM dNTPs, 1 µM jedes Primers, 1U Taq-Polymerase, 50 ng DNA oder 2 µl verdaute DNA mit Primern und Thermocycler-Bedingungen enthielt, die zuvor beschrieben wurden46. Die Genotypisierung wurde unter Verwendung von FLA auf dem 3130xl ABI Genetic Analyzer mit ROX500-Größenstandard (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Der Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) wurde mit Geneious Prime Version 2022.01 mit Mikrosatelliten-Plugin (https://www.geneious.com) bestimmt. Die Peakhöhen wurden mit der ImageJ-Software63 gemessen und anschließend das Höhenverhältnis berechnet. DNA aus einer weiblichen Probe mit bekanntem XCI-Muster (100:0) wurde während der gesamten Analysepipeline als Kontrolle verwendet.

Drei CRISPR-RNAs (crRNAs) auf beiden Seiten jeder interessierenden Region in den AR- und RP2-Genen wurden mit CHOPCHOP64 entworfen und gemäß den zuvor beschriebenen Anweisungen ausgewählt (Cas-vermittelte PCR-freie Anreicherungsprotokollversion: ENR_9084_v109_revD_04Dec2018). Alle speziell entwickelten Alt-R-crRNAs (Integrated DNA Technologies, Ergänzungstabelle 2) wurden als äquimolare Mischung aus crRNAs (100 µM) gepoolt und mit transaktivierenden crRNAs (tracrRNAs) (Integrated DNA Technologies, Kat. 1073190) unter Verwendung von Duplex-Puffer zusammengesetzt ( Integrated DNA Technologies, Kat. 11010301) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Cas9-Anreicherung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von 4–5 μg DNA und Langfragmentpuffer (Cas-vermitteltes PCR-freies Anreicherungsprotokoll SQK-CS9109) durchgeführt. Die Proben wurden auf einer MinION R9.4.1-Durchflusszelle analysiert und mit der MinKNOW-Software (Version 20.10.3) betrieben.

Das Base-Calling wurde mit Bonito Basecaller (Version 0.3.8) durchgeführt und die Lesevorgänge wurden mit minimap2 (Version 2.18-r1015) auf das menschliche Referenzgenom (GRCh38/hg38) abgeglichen. Für die weitere Analyse wurden nur Lesevorgänge berücksichtigt, die auf die interessierenden Regionen im AR (chrX:67543761–67546170, hg38) und im RP2-Gen (chrX:46836539–46837273, hg38) abzielen. Um Wiederholungsaufrufe zu ermöglichen, wurde eine interne Datenbank mit Referenzgenomen erstellt, die 5–40 CAG-Wiederholungen (AR-Gen) und 5–30 GAAA-Wiederholungen (RP2-Gen) enthielten. Der Bereich der im Alignment verwendeten Wiederholungszahlen wurde zuvor in der nicht betroffenen Allgemeinbevölkerung beschrieben (im Bereich von 9 bis 38 in AR und 10–20 in RP2)46,65. Wiederholungsaufrufe wurden durch Abgleich mit der internen Datenbank mithilfe von minimap2 (Version 2.18-r1015) durchgeführt und die Anzahl der Wiederholungen in den Lesevorgängen wurde mithilfe des Integrative Genomics Viewer (Version 2.10.0, Basisqualität > 20) identifiziert. Die Daten wurden durch Auftragen der Anzahl der Lesevorgänge (y-Achse) visualisiert, die Wiederholungen im Bereich von 5–40 Wiederholungen in AR oder 5–30 Wiederholungen in RP2 (x-Achse) enthielten (ergänzende Abbildung 3). Die Lesevorgänge wurden basierend auf der Wiederholungszahl und dem Vergleich mit den Ergebnissen des Goldenen Standards in Haplotypen unterteilt. Das Aufrufen der Methylierung und die Berechnung der Methylierungshäufigkeit wurden mit dem Nanopolish-Softwarepaket (Version 0.12.0) durchgeführt. In die Methylierungsanalyse wurden nur Standorte mit einem Log-Likelihood-Verhältnis > 2,5 (methyliert) oder < – 2,5 (nicht methyliert) einbezogen (ergänzende Abbildung 5). Bam-Dateien wurden mit dem Paket „Converting Bam for igv“66 konvertiert und der Methylierungsstatus wurde mit dem Integrative Genomics Viewer Bisulfit-Modus CG (Version 2.10.0) visualisiert. Der XCI-Status wurde ermittelt, indem die durchschnittliche Methylierungshäufigkeit in der Region chrX:67543761–67546170 (AR-Gen, 116 CpG-Stellen, hg38) und in der Region chrX:46836539–46837273 (RP2-Gen, 58 CpG-Stellen, hg38) verwendet und anschließend berechnet wurde Verhältnis der durchschnittlichen Methylierung zwischen den Allelen in jedem Gen.

Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze sind im Repository des European Nucleotide Archive (ENA) verfügbar, [Studienzugang: PRJEB53974, ERP138789]“.

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Wir möchten der Familie für ihre Teilnahme an dieser Studie danken. Vielen Dank an Mai-Britt Mosbech und Kollegen vom Uppsala Genome Center, National Genomics Infrastructure/SciLifeLab, Universität Uppsala für wertvolle technische Unterstützung beim DNA-Extraktionsverfahren. Vielen Dank an das Analystenteam von Klinisk Genetik, Universitätsklinikum Uppsala, für den Beitrag zur FLA-Analyse.

Open-Access-Finanzierung durch die Universität Uppsala. Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Magnus Bergvalls Foundation, der Swedish Society of Medicine, der Nilsson-Ehle Foundation, der Swedish Society for Medical Research (SSMF), der Åke Wiberg Foundation, der Jeansson Foundation, der Svenska læker sälläket (SLS) und der Tore Nilsson Foundation unterstützt. JJ und SG wurden durch Zuschüsse der Sävstaholm-Stiftung unterstützt. SL, ML, MW und JJ wurden durch Zuschüsse aus der „Vereinbarung zwischen dem schwedischen Staat und bestimmten Bezirksräten über die Zusammenarbeit bei der Grundausbildung von Ärzten, der medizinischen Forschung und der Entwicklung der Gesundheitsfürsorge“ (ALF) unterstützt. SG wurde von der Knut und Alice Wallenberg Stiftung unterstützt.

Abteilung für Immunologie, Genetik und Pathologie, Science for Life Laboratory, Universität Uppsala, Husargatan 3, Box 815, SE-751 08, Uppsala, Schweden

Josefin Johansson, Sarah Lideus, Ida Höijer, Adam Ameur, Göran Annerén, Marie-Louise Bondeson und Maria Wilbe

Programm für Medizin- und Populationsgenetik, Broad Institute of MIT und Harvard, Cambridge, MA, USA

Sanna Gudmundsson

Abteilung für Genetik und Genomik, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Sanna Gudmundsson

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JJ, M.-LB und MW haben die Studie konzipiert. JJ, MW, M.-LB und AA trugen mit experimentellem und analytischem Design bei. M.-LB und GA haben mit Patientenmaterial beigetragen. JJ, SL, IH und SG führten die Experimente durch. JJ, SL, ME und MW führten die Analyse durch. JJ illustrierte und bereitete die Figuren vor. JJ und MW haben das Manuskript entworfen. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Maria Wilbe.

JJ, MW und ML.B: Patentanmeldung anhängig „QUANTIFICATION OF X-CHROMOSOM INACTIVATION“ (Anmeldenummer 2250254-6). SL, GA, SG, AA, ME, IH: Keine konkurrierenden Interessen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Johansson, J., Lidéus, S., Höijer, I. et al. Eine neuartige quantitative gezielte Analyse der X-Chromosomen-Inaktivierung (XCI) mittels Nanoporensequenzierung. Sci Rep 13, 12856 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34413-3

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Eingegangen: 12. April 2022

Angenommen: 29. April 2023

Veröffentlicht: 08. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34413-3

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Eine neuartige quantitative gezielte Analyse von X